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PNAS , 磷酸化蛋白质组学分析揭示内皮屏障功能的调节机制
时间:2020-03-12   浏览:136次

       2020年3月初,发表在PNAS上的加州大学圣地亚哥分校的JoAnn Trejo教授研究团队的研究成果,运用了磷酸化蛋白质组学技术揭示了内皮屏障功能的信号调节机制。论文的题目为:Phosphoproteomic Analysis of Protease-Activated Receptor-1 Biased Signaling Reveals Unique Modulators of Endothelial Barrier Function

         血管内皮功能障碍是炎症的标志,并且会导致败血症和其他疾病中的血管渗漏、组织水肿和器官衰竭等症状。内皮功能障碍是由炎症介质触发的,很多是通过G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors ,简称GPCRs)介导,其中一个关键炎症介质是凝血酶( Thrombin),它是一种因血管损伤和炎症反应产生的促凝血蛋白酶。凝血酶刺激多种炎症反应,包括通过剪切蛋白酶激活受体1(Protease-activated receptor-1,简称PAR1)等诱导多个信号通路破坏内皮屏障。除了凝血酶外,活化蛋白C(Activated protein C ,简称APC)也可特异性剪切PAR1,但APC是一种天然抗凝蛋白酶,其功能为增强内皮屏障的稳定性以及抗炎反应。凝血酶和APC之间的这种拮抗作用调节内皮屏障完整性以及炎症反应的具体机制目前仍知之甚少,为了阐明该过程的相关途径和蛋白质,作者使用定量磷酸化蛋白质组学方法,分析了凝血酶和APC介导PAR1信号通路的全磷酸化蛋白质组。

       已知凝血酶和APC分别通过在R41和R46在N末端的酶切激活PAR1,并诱导一些磷酸化过程。为了鉴定由二者引起的蛋白磷酸化,作者分别用凝血酶或APC刺激EA。hy926细胞,各选择了三个时间点 前者在0、 2。5min、与 5 min,后者 0、 15min、30 min,以捕获与它们各自的生物学反应的有关磷酸化的变化。用TiO2富集磷酸化肽段,进行TMT 10-plex标记处理,并通过液相色谱-MS2/MS3分析以定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组。一共定量到了超过10000个磷酸化肽段,磷酸化位点分布在S、T、Y上。并选择了p38 T38/Y182与Akt S473磷酸化水平进行了免疫印迹分析验证。

                

            为了从质谱检测磷酸化位点信息中挖掘更有价值的信息,作者使用k均值聚类分析了凝血酶和APC刺激下磷酸化蛋白质组随时间的变化。聚类一共将蛋白质分成了6组聚类(Cluster),在这6组中凝血酶和APC诱导的磷酸化水平变化都存在差异,且磷酸化水平与诱导时间紧密相关。对这6组磷酸化蛋白进行基因本体聚类分析,比较了各组在刺激时间点检测结果所表现的生物学过程,如微管、细胞黏附与连接、mRNA剪切、DNA结合、染色质调节等相关。

               

       鉴于微管、细胞黏附等过程都与内皮屏障稳定性有关,而涉及这些过程的磷酸化蛋白质又非常丰富,作者假设存在一部分以前未发现与凝血酶或APC功能相关的蛋白质可能调节内皮屏障的完整性。Afadin(AFDN)是一种肌动蛋白丝结合蛋白,与黏附连接相关,并在凝血酶刺激后磷酸化水平改变,但未在APC处理的细胞中显示出明显的磷酸化变化;Adducin-1(ADD1)是肌动蛋白动力学的关键调节剂,APC诱导其磷酸化水平改变,但未在凝血酶处理的细胞中显示出明显的磷酸化变化。为了研究这些蛋白在内皮屏障调节中的功能,作者用siRNA进行了基因敲低实验。在缺乏AFDN的细胞中,凝血酶诱导屏障通透性增大的幅度提升;而在缺乏ADD1的细胞中,凝血酶诱导屏障通透性增大的效果几乎被消除了。结果表明,AFDN和ADD1均是内皮屏障功能的重要调节剂。

                    

     总的来说,作者研究GPCR激活的蛋白酶激活的受体1(被两种不同的蛋白酶激活)的总体磷酸化蛋白质组学信号分析的特性,以鉴定途径和丰富的蛋白质,这些蛋白质和蛋白质赋予内皮屏障完整性以偏向的信号和相反的功能。作者的结果揭示了凝血酶和APC诱导下细胞独特的动态磷酸化蛋白质组,以及与基因表达和内皮屏障功能相关的多种丰富的生物学功能的鉴定,并发现AFDN和ADD1是内皮屏障功能的调节剂。这些研究确定了在人内皮细胞中引起PAR1相关信号传导的多种蛋白质和途径。

 

原文链接:https://www.pnas.org/content/117/9/5039
原文DOI:10.1073/pnas.1917295117
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