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Nature , 解析泛素链结构新工具:泛素“剪刀”Lbpro
时间:2019-08-18   浏览:464次

       2019年8月15日Nature发表了题目为“Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping”解析泛素化结构的最新研究成果,文章的通讯作者是澳大利亚沃尔特与伊丽莎-霍尔医学研究所的David Komander教授。他的研究兴趣是泛素信号传导以及去泛素化过程。

      泛素修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,能够广泛地影响细胞生理过程。过去数十年对泛素修饰的研究主要依赖质谱技术,利用对胰酶(trypsin)消化蛋白后会在泛素修饰位点产生具有Gly-Gly结构,随后可以利用针对Gly-Gly的抗体进行富集来鉴定泛素化的修饰位点,或者标记含114Da的Gly-Gly结构的肽段来进行定量,以分析聚泛素链的组成以及泛素的磷酸修饰和乙酰化修饰信息。但是胰酶消化蛋白后会丢失聚泛素链的结构信息,尽管开发了一些技术来弥补这个缺点,譬如限制性胰酶消化、泛素链限制性分析以及识别Lys11/Lys48支链连接的抗体,这些可以提供部分聚泛素链的结构信息,但是这些方法都需要大量实验优化以及丰富的经验。因此,需要开发一种可以简单普适解析聚泛素化链结构的工具。

     作者在之前的研究中发现由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)的前导蛋白(leader protease,Lbpro)可以水解ISG15蛋白的泛素样(ubiquitin-like)修饰的Arg155与Gly156之间的肽键,从而产生GlyGly修饰。作者通过研究发现Lbpro几乎可以水解所有类型的二聚泛素修饰的Arg74与Gly75,产生泛素1-74短肽(分子量8,450。6 Da)和GlyGly修饰的泛素1-74短肽(8,564。6 Da)。两者之前的分子量相差114 Da。因此作者可以利用Lbpro作为泛素化修饰的剪刀,将酶切后的泛素进行SDS-PAGE分离和绝对定量质谱分析,最后根据泛素上的GlyGly修饰数目来获得聚泛素链的结构修饰。

图1 | Lbpro剪切ubiqutin后产生GlyGly修饰的蛋白质。 a,将Lbpro与不同连接的双泛素(diUb)一起孵育24小时。 将反应物进行SDS-PAGE并通过银染色显现。一式三份进行的实验的代表性实例所示。b,Lbpro处理通过电喷雾电离质谱法分析Lys48-diUb。显示了解卷积的原始光谱8,450.57 Da峰,远端ubiqutin,不含C末端Gly75-Gly76序列; 8,564.61 Da峰(质量差,Δmass,114.04Da),具有明显野生型质量的近端ubiqutin:切割的缺失C末端GlyGly序列通过GlyGly与Lys48的连接来平衡。一个以技术三份重复进行的实验的代表性实例是所示。 c,Lbpro切割位点的示意图。 Lbpro两次切割二泛素在每个遍在蛋白部分的Arg74之后。 d,Lbpro产生GlyGly修饰的蛋白质组,也可以深入了解泛素链结构。

接下来,作者利用这种泛素剪刀Lbpro对不同类型E2/E3连接酶产生的6不同类型的聚泛素链结构进行准确定量分析。为了排除游离泛素的干扰,作者将Lbpro和tandem ubiquitin-binding entity (TUBE) pull-down assays结合除去游离泛素,准确定量修饰在蛋白上的聚泛素链结果信息。作者进一步将这种方法应用在细胞裂解样品中,先用泛素剪刀Lbpro处理HEK293、HeLa、HCT116三种细胞裂解液,随后通过WB检测和分离Lbpro剪切下的泛素,最后质谱定量分析剪切后的泛素GlyGly修饰数目,从而得到聚泛素链的结构信息。结果发现三组细胞内有4%-7%的泛素有两个GlyGly修饰,说明整体泛素修饰中上有10%-20%的泛素是以支链形式存在于聚泛素链中的。

最后,作者利用这种泛素剪刀Lbpro研究了PINK1/parkin驱动的线粒体自噬过程中的聚泛素链结构信息,结果发现E3连接酶parkin激活后,线粒体内和线粒体膜上蛋白的磷酸化的泛素比例明显增高,而泛素各个类型支链结构没有明显的变化,说明线粒体的自噬主要受磷酸化的泛素修饰比例调控,并且这些磷酸化修饰的泛素主要是在聚泛素链的末端。

总之,本文开发了一种能对泛素进行位点特异性酶切的泛素剪刀,能够通过预处理蛋白样品测量不同的泛素链结构,随后利用电泳和质谱分析它们,这为解析聚泛素链的结构信息以及研究泛素信号传递提供了有力工具。
 
文章链接:https://www.nature.com/articles/s41586-019-1482-y
文章引用:DOI:10.1038/s41586-019-1482-y

 

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