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Cell : 华人科学家合作利用原位蛋白组学方法揭示大脑中神经元联结的调控分子
时间:2020-01-18   浏览:366次
       近日,科学家利用了一种新的研究策略,可以靶向研究驻留在特定细胞表面的蛋白质。这项技术可洞悉大脑细胞在发育过程中如何形成复杂的网络。就像投下一个很小的网一样,这种新技术将果蝇大脑中神经元表面的所有蛋白质聚集在一起。这次的研究发现了参与大脑发育的20个新分子。这项研究成果发表于2020年1月16日在《细胞》杂志上。这一发现进一步促进了科学家对大脑中神经元如何形成复杂网络的理解。研究研究者霍华德·休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute )华人研究员Liqun Luo说,这首次证明了这种蛋白质发现方法实际上可以在完整的脑组织中起作用,而不仅仅是在实验室中培养的细胞。这很重要,因为组织环境对于细胞的发育至关重要,而实验室细胞培养不能复制它。到目前为止,科学家还没有办法监测像大脑这样的复杂组织细胞表面上的所有蛋白质。新方法提供了一种方法来调查以前神秘的景观。
       该工作发展了一种高时空分辨率的蛋白组学技术,通过基因编码的过氧化氢酶HRP(horseradish peroxidase)直接在完整果蝇大脑内对指定细胞类型的表面蛋白组进行高精度的生物素标记,富集和分析。基于这一方法,作者对幼虫和成年果蝇两个时间点大脑嗅觉系统投射神经元(projection neuron)的表面蛋白组的动态变化进行了定量分析,揭示了从发育到成熟过渡过程中神经元联结分子的整体下调和突触分子的整体上调。基于蛋白组学的数据而进行的体内筛选发现了细胞表面20个调控嗅觉系统神经回路的新分子,其中大多属于以前认为与神经发育无关、进化保守的蛋白家族。
 
        
                                  图1:大脑的嗅觉投射神经元的细胞表面原位的生物素化
(A)完整组织中细胞表面生物素化的方案和特征。(B)嗅觉投射神经元(PN)特异的VT033006-GAL4(以下称为PN-GAL4)驱动膜靶向GFP(CD4-GFP)的表达。 局部放大图显示了PN体区域的单个光学部分。 橙色圆圈,触角裂片。(C和D)细胞表面生物素化反应后触角叶的中性抗生物素蛋白染色。(C)阴性对照:缺失GAL4启动子未表达HRP。
 
接下来,研究者通过生物素标记,富集与质谱定量检测,进行蛋白质组定量研究分析。研究者在两个时间点对PN表面蛋白质组进行了剖析:形成(APF)后36小时,当发育PN时,它们会细化其树突和轴突以建立突触连接,以及在隐匿成年后5天, 当成熟的PN积极地处理嗅觉信息时。
 
       
 
                                   图2:发育中和成熟PN的细胞表面蛋白质组学分析
 
(A)PN表面蛋白质组分析的工作流程。(B)基于8重串联质量标签(TMT8)的定量蛋白质组实验的设计。每个时间点包含两个生物学重复(蓝色或红色)和两个阴性对照(灰色)。 TMT行中的标签(例如127C)指示用于每种条件的TMT标签。(C)比例分析和截止分析的每个步骤后的蛋白质数量。(D)每个生物复制品的受体工作特性(ROC)曲线。基于TMT比率,蛋白质按降序排列。真阳性表示通过UniProt数据库整理的质膜蛋白。假阳性包括核蛋白,线粒体蛋白和胞质蛋白,而UniProt没有膜注释。顶部放大了20%的区域(绿色虚线框)。使用两样本Wilcoxon秩和检验确定统计显着性。(E)经过比例和截止分析后,发育中和成熟的PN表面蛋白质组的维恩图。这两个蛋白质组总共包含712个蛋白质,两个阶段共有252个蛋白质。(F)生物复制品的相关性。(G)GO分析发育中的和成熟的PN表面蛋白质组的前5个 cellular compartment
 
对质谱鉴定的数据进行比例与cutoff分析,得到了空间上细胞表面特异性极高的蛋白组,以及各个蛋白在不同发育阶段的定量变化关系:在幼虫的神经元表面,与神经发育和神经回路联结相关的蛋白被高度富集;而与突触信息传递、离子通道等相关的分子则在成年大脑中被富集。值得一提的是,这种蛋白组学方法一次性就发现了绝大部分过去几十年内逐一被研究的重要联结分子。
 
       
                    图3.根据PN的发育和功能,分析细胞表面蛋白质组的时间演变
 
(A)GO分析中发育和成熟的PN表面蛋白质组的前5个生物学过程 (biological process)(B)分别在发育和成熟的PN表面上最富集的蛋白质。蓝色,已知的神经发育分子;红色,已知的突触传递分子。
(C和D)基于TMT的定量(C中的比较方案)揭示了PN发育和成熟过程中细胞表面蛋白的表达变化。(E)在发育中和成熟的PNs中功能相关分子复合物的协调表达变化。使用STRING(用于检索相互作用的基因/蛋白质的搜索工具)数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用评分进行马尔可夫聚类。灰线表示蛋白质-蛋白质相互作用。节点根据表达式的变化进行颜色编码(底部颜色比例)。(F)PN表面分子的RNA与蛋白质变化。虚线描绘了线性回归。
 
    为了研究幼虫表面富集但目前未知与神经发育相关的蛋白质,作者设计了一套体内筛选方法,通过RNAi降解的手段详细研究了20个蛋白对于神经发育的影响,并发现研究的20个蛋白全部对于神经发育有重要作用,(如图4),。令人惊喜的是,这些新发现的分子中很多属于意料之外的蛋白家族,比如一些脂肪酶、肽酶等。它们在进化上高度保守,却第一次被发现与神经发育相关,这极大的拓展了研究调控神经回路分子机制的外沿。最后,作者选取了其中一个蛋白,LRP1,进行了详细的遗传学分析,确认了其在调控嗅觉系统投射神经元树突的靶向的重要作用。
 
     
                  图4:遗传筛选确定神经回路装配的调节分子
 
总之,该文章发展了一种针对完整组织器官中指定细胞类型的表面蛋白组学技术,具有极高的时间和空间分辨率。作者将该技术应用于研究果蝇大脑中嗅觉神经元的发育过程,发现和验证了一系列此前未知的重要调控分子。正如马克斯·普朗克生物化学研究所(Max Planck Institute of Biochemistry)的生物化学家马蒂亚斯·曼恩( Matthias Mann )说:“真正让我震惊的是生物学方面的跟进。”没有参与这项工作的曼恩说,罗的团队能够找到大量蛋白质,这些蛋白质的生物学作用以前是未知的。
 

原位链接: Jiefu Li, et al. (2020) Cell-Surface Proteomic Profiling in the Fly Brain Uncovers Wiring Regulators.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.029

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